Métodos de enriquecimento de NGS influenciam fortemente a avaliação do TMB

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A carga mutacional do tumor é afetada pelo método de enriquecimento de NGS em amostras altamente desaminadas de tumores sólidos

Trabalho com dados brasileiros sobre carga mutacional e como esta avaliação é afetada pela qualidade da amostra utilizada para o sequenciamento foi apresentado no AACR 2020. Dr. Luiz Henrique Araújo, médico oncologista e pesquisador do Instituto Nacional do Câncer (INCA), do Instituto COI e assessor médico do laboratório Progenética, comenta o estudo, que avaliou se o TMB (tumor mutational burden) é afetado pelo método de enriquecimento de NGS (next generation sequencing) em amostras clínicas de tumores sólidos.

O TMB é um promissor biomarcador preditor de resposta à imunoterapia em certos cânceres. Pode ser definido como o número de mutações somáticas não-sinônimas por megabase (Mb) no genoma de um câncer. Esperadamente, amostras clínicas podem apresentar alterações químicas e estruturais (artefatos de DNA) que poderiam levar a medições imprecisas do TMB. A desaminação da citosina (C:G>T:A) é um fenômeno bem conhecido em amostras conservadas em blocos de parafina, produzindo erros no NGS. Neste estudo, foi medido o TMB em amostras de blocos de parafina usando dois painéis de NGS para implementação de diagnósticos de rotina.

A avaliação do TMB foi realizada em amostras clínicas por NGS baseado em enriquecimento por amplicons (n = 9) e/ou por hibridização (n = 8). Os valores de TMB foram comparados para o tratamento com uracil-DNA glicosilase (UDG) antes do método de enriquecimento. As amostras também foram comparadas de acordo com os resultados anteriores em um NGS clinicamente certificado e em um ensaio interno de instabilidade por microssatélites (MSI). TMB ≥ 10 mutações/Mb foi considerado alto e MSI ≥ 20% foi considerado instável.

A concordância entre os valores de TMB pelos 2 métodos de NGS foi de 75% e 62,5% com e sem tratamento com UDG, respectivamente. UDG reduziu o artefato atual C:G>T:A para ambas as abordagens de enriquecimento, reforçando sua presença no DNA do FFPE. No entanto, não houve alterações nos resultados de TMB para os dois métodos.

Para o NGS de amplicons, foi observado um alto ruído de linha de base em amostras com altos escores de desaminação, levando à superestimação do TMB (> 350), que não puderam ser corrigidas mesmo após o tratamento com UDG e o ajuste de bioinformática do fabricante. Curiosamente, as mesmas amostras apresentaram baixos valores de TMB para o método de hibridização. Amostras com baixas taxas de desaminação não foram influenciadas pelo tratamento com UDG ou ajuste de bioinformática, independentemente do método de enriquecimento.

Os valores de TMB de um NGS certificado foram completamente concordantes para o NGS por hibridização, mas apenas 25% para amplicons. O MSI foi totalmente concordante entre o NGS certificado e o NGS por hibridização. Nenhum parâmetro de controle de qualidade previu diferenças entre amostras desaminadas altas e baixas.

Os autores concluem que os métodos de enriquecimento do NGS influenciaram fortemente a avaliação do TMB. A captura por hibridização apresentou melhor desempenho do que a baseada em amplicons. Esse método merece prioridade na validação clínica para avaliar TMB em painéis gênicos locais, principalmente em laboratórios que lidam com amostras clínicas altamente desaminadas.

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Referência:
Session PO.CL11.02 – Predictive Biomarkers for Treatment Efficacy 1
1996 / 4 – Tumor mutational burden is affected by next-generation sequencing enrichment method in highly deaminated samples from solid tumors
https://www.abstractsonline.com/pp8/#!/9045/presentation/3958

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